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pp电子首页具有透皮能力和白细胞介素-10活性的融合蛋白及其编码基因与应用pdf

【概要描述】　　pp电子官网，精密制造，pp电子设备，pp电子游戏。pp电子官方网站，PP电子APP下载！pp电子(中国)·官方网站。pp电子官网3、10 活性的融合 蛋白及其编码基因与应用 (57) 摘要 本发明公开了具有透皮能力和白细胞介素10 活性的融合蛋白及其编码基因与应用。本发明提 供了一种融合蛋白， 是在人白细胞介素 10 蛋白的 羧基末端连接如下任一所述蛋白， 且在氨基末端 连接转运肽形

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【概要描述】　　pp电子官网，精密制造，pp电子设备，pp电子游戏。pp电子官方网站，PP电子APP下载！pp电子(中国)·官方网站。pp电子官网3、10 活性的融合 蛋白及其编码基因与应用 (57) 摘要 本发明公开了具有透皮能力和白细胞介素10 活性的融合蛋白及其编码基因与应用。本发明提 供了一种融合蛋白， 是在人白细胞介素 10 蛋白的 羧基末端连接如下任一所述蛋白， 且在氨基末端 连接转运肽形

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　　pp电子官网◈ღ★✿，精密制造◈ღ★✿，pp电子设备◈ღ★✿，pp电子游戏◈ღ★✿。pp电子官方网站◈ღ★✿，PP电子APP下载◈ღ★✿！pp电子(中国)·官方网站◈ღ★✿。pp电子官网3◈ღ★✿、10 活性的融合 蛋白及其编码基因与应用 (57) 摘要 本发明公开了具有透皮能力和白细胞介素10 活性的融合蛋白及其编码基因与应用◈ღ★✿。本发明提 供了一种融合蛋白◈ღ★✿， 是在人白细胞介素 10 蛋白的 羧基末端连接如下任一所述蛋白◈ღ★✿， 且在氨基末端 连接转运肽形成的融合蛋白 ◈ღ★✿： 1)人IgG Fc-1或 其突变蛋白 ◈ღ★✿； 2) 人 IgG Fc-2 或其突变蛋白 ◈ღ★✿； 所 述人白细胞介素 10 蛋白的氨基酸序列为序列表 中序列 2 自氨基末端第 12-171 位的氨基酸序列 ◈ღ★✿； 所述转运肽的氨基酸序列为序列表中序列 2 自氨 基末端第1-11位的氨基酸序列◈ღ★✿。 本发明的实验证 明◈ღ★✿， 本发明提供了一种同时具有

　　4◈ღ★✿、透皮能力和白细 胞介素 10 活性的融合蛋白◈ღ★✿， 在治疗自身免疫性反 应特别是银屑病药物的制备领域具有较大的实际 意义和广阔的应用前景◈ღ★✿。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 马骞 权利要求书 2 页 说明书 10 页 序列表 11 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 2 页 说明书 10 页 序列表 11 页 附图 3 页 1/2 页 2 1. 一种融合蛋白◈ღ★✿， 其特征在于 ◈ღ★✿： 所述融合蛋白为序列表中的序列 2 所示的氨基酸序列 组成的蛋白◈ღ★✿。 2. 权利要求 1 所述融合蛋白的编码基因◈ღ★✿。 3. 根据权利要求 2 所述融合蛋白的编码基因

　　5◈ღ★✿、◈ღ★✿， 其特征在于 ◈ღ★✿： 所述融合蛋白的编码基因 是下述 1) 或 2) 所述基因 ◈ღ★✿： 1) 序列表中序列 1 所示的 DNA 分子 ◈ღ★✿； 2) 序列表中序列 1 自 5 末端第 256-1464 位核苷酸所示的 DNA 分子◈ღ★✿。 4.含有权利要求2或3所述融合蛋白的编码基因的重组表达载体◈ღ★✿、 转基因细胞系◈ღ★✿、 表达 盒或重组菌◈ღ★✿。 5. 根据权利要求 4 所述的重组表达载体◈ღ★✿， 其特征在于 ◈ღ★✿： 所述重组表达载体为将权利要求2或3所述融合蛋白的编码基因插入如下任一出发载 体的多克隆位点得到的载体 ◈ღ★✿： pPIC9K◈ღ★✿、 pPIC9◈ღ★✿、 pPIC3◈ღ★✿、 pPICZpp电子首页◈ღ★✿、 pHIL-D1◈ღ★✿、 pA0804◈ღ★✿、 pA0815 或 p

　　6宠妃易孕系统◈ღ★✿、PSC3K◈ღ★✿。 6. 根据权利要求 4 所述的重组菌宠妃易孕系统◈ღ★✿， 其特征在于 ◈ღ★✿： 所述重组菌为将权利要求 4 或 5 所述 的重组表达载体导入宿主菌得到的重组菌◈ღ★✿， 所述宿主菌为毕氏酵母◈ღ★✿。 7. 根据权利要求 6 所述的重组菌◈ღ★✿， 其特征在于 ◈ღ★✿： 所述毕氏酵母为 GS115◈ღ★✿、 KM71 或 SMD1168◈ღ★✿。 8. 一种制备权利要求 1 所述融合蛋白的方法◈ღ★✿， 包括如下步骤 ◈ღ★✿： 1) 诱导培养权利要求 6 或 7 所述重组菌◈ღ★✿， 离心收集上清液 ◈ღ★✿； 2) 纯化步骤 1) 获得的上清液◈ღ★✿， 得到融合蛋白 ◈ღ★✿； 在步骤 1) 中◈ღ★✿， 所述诱导培养的温度为 30◈ღ★✿， 所述诱导所用的培养基为添加有甲醇的 培养基◈ღ★✿， 所述甲醇在所述诱

　　7◈ღ★✿、导所用的培养基中的浓度为 0.5体积百分含量◈ღ★✿， 所述诱导方式 为 ◈ღ★✿： 每隔 24h 补加甲醇至终浓度为 0.5体积百分含量 ◈ღ★✿； 在步骤 2) 中◈ღ★✿， 所述纯化的方式为 ◈ღ★✿： 依次进行亲和层析和分子筛层析◈ღ★✿， 所述亲和层析的 层析柱为 Mabselect◈ღ★✿， 所述分子筛层析的层析柱为 S200HR 预装柱 ◈ღ★✿； 所述亲和层析的洗脱液为浓度为 50mM◈ღ★✿、 pH 为 3.5 的醋酸钠水溶液 ◈ღ★✿； 所述分子筛层析的洗脱液由 17.55g 氯化钠和 1000ml 浓度为 20mM◈ღ★✿、 pH 为 8.0 的 TrisHCl 缓冲液组成◈ღ★✿。 9. 权利要求 1 所述的融合蛋白在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用◈ღ★✿。 10.

　　8◈ღ★✿、根据权利要求 9 所述的应用◈ღ★✿， 其特征在于 ◈ღ★✿： 所述自身免疫性疾病为银屑病◈ღ★✿。 11. 权利要求 2 或 3 所述融合蛋白的编码基因在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应 用◈ღ★✿。 12. 根据权利要求 11 所述的应用◈ღ★✿， 其特征在于 ◈ღ★✿： 所述自身免疫性疾病为银屑病◈ღ★✿。 13. 权利要求 1 所述的融合蛋白在制备抑制 IFN- 产生的抑制剂中的应用◈ღ★✿。 14.权利要求2或3所述融合蛋白的编码基因在制备抑制IFN-产生的抑制剂中的应 用◈ღ★✿。 15. 一种治疗自身免疫性疾病药物◈ღ★✿， 其活性成分为权利要求 1 所述的融合蛋白◈ღ★✿、 权利要 求 2 或 3 所述融合蛋白的编码基因或权利要求 4 或 5 所述的重组表达载体◈ღ★✿。

　　9◈ღ★✿、 16.一种抑制IFN-产生的抑制剂◈ღ★✿， 其活性成分为权利要求1所述的融合蛋白◈ღ★✿、 权利要 权 利 要 求 书 CN 101962413 B 2 2/2 页 3 求 2 或 3 所述融合蛋白的编码基因或权利要求 4 或 5 所述的重组表达载体◈ღ★✿。 权 利 要 求 书 CN 101962413 B 3 1/10 页 4 具有透皮能力和白细胞介素 -10 活性的融合蛋白及其编码 基因与应用 技术领域 0001 本发明涉及融合蛋白及其编码基因与应用◈ღ★✿， 特别是涉及由具有 “转运肽” 和人白细 胞介素 -10 活性的融合蛋白及其编码基因◈ღ★✿， 以及该融合蛋白的表达方法和在制备治疗自身 免疫性反应特别是银屑病药物中

　　10◈ღ★✿、的应用◈ღ★✿。 背景技术 0002 白细胞介素 -10(Interleukin-10◈ღ★✿， IL-10) 是一种多功能的细胞因子◈ღ★✿， 能够抑制 T 细胞介导的免疫炎症反应◈ღ★✿， 参与体液免疫调节◈ღ★✿。研究表明◈ღ★✿， IL-10 在组织特异性自身免疫 性损伤的启动和发展中起着关键性作用◈ღ★✿， 并已应用于包括 I 型糖尿病◈ღ★✿、 银屑病◈ღ★✿、 类风湿关节 炎◈ღ★✿、 多发性硬化pp电子首页◈ღ★✿、 丙型肝炎等多种免疫性疾病的临床实验研究◈ღ★✿。 其中对银屑病的治疗效果表 现最为明显◈ღ★✿， 欧美国家均已完成 II 期临床观察◈ღ★✿。 0003 然而细胞因子这样具有生物活性的药物◈ღ★✿， 半衰期太短◈ღ★✿， 例如 IL-10 在体内的半衰 期仅仅 2-3h◈ღ★✿， 蛋白很快被清除◈ღ★✿， 无法持续发

　　11◈ღ★✿、挥治疗作用◈ღ★✿， 因而需要大剂量地频繁使用才能达 到有效的治疗浓度◈ღ★✿， 然而如此频繁用药很不方便且很痛苦◈ღ★✿， 以致某些患者无法忍受该药物 治疗◈ღ★✿。因此◈ღ★✿， 迫切需要疗效显著◈ღ★✿， 半衰期长且毒副作用小的 IL-10◈ღ★✿。 0004 同时在 II 期临床观察中也发现◈ღ★✿， IL-10 使用剂量小则治疗效果差 ◈ღ★✿； 而提高剂量则 产生明显副作用◈ღ★✿。其原因主要由于注射给药是目前蛋白质类药物的唯一给药途径◈ღ★✿， 而由于 IL-10 属强天然免疫抑制剂◈ღ★✿， 系统性注射给药时◈ღ★✿， 可导致全身免疫抑制而出现副作用◈ღ★✿。 0005 TD-1是最新发现的一个含有11个氨基酸的透皮多肽◈ღ★✿， 可帮助生物大分子(如胰岛 素◈ღ★✿、 生长激素和荧光素 ) 透过皮肤◈ღ★✿，

　　12◈ღ★✿、 进入血液循环宠妃易孕系统◈ღ★✿， 是目前发现的唯一透皮多肽◈ღ★✿， 被认为具 有改变蛋白质药物给药途径的创新性突破◈ღ★✿。 0006 因此◈ღ★✿， TD1 成为了 IL-10 改变给药途径治疗银屑病的新切入点◈ღ★✿。 发明内容 0007 本发明的一个目的是提供一种融合蛋白及其编码基因◈ღ★✿。 0008 本发明提供的融合蛋白◈ღ★✿， 命名为 TD1-IL10-IgG/Fc-1◈ღ★✿， 人工合成◈ღ★✿， 是在人白细胞 介素 10- 蛋白的羧基末端连接如下任一所述蛋白◈ღ★✿， 且在氨基末端连接转运肽形成的融合蛋 白 ◈ღ★✿： 0009 1) 人 IgG Fc-1 或其突变蛋白 ◈ღ★✿； 0010 2) 人 IgG Fc-2 或其突变蛋白 ◈ღ★✿； 0011 所述人白细胞介素-10蛋白的

　　13◈ღ★✿、氨基酸序列为序列表中序列2自氨基末端第12-171 位的氨基酸序列 ◈ღ★✿； 0012 所述转运肽 (TD1) 的氨基酸序列为序列表中序列 2 自氨基末端第 1-11 位的氨基 酸序列◈ღ★✿。 0013 所述融合蛋白为如下 1) 或 2) 的蛋白 ◈ღ★✿： 说 明 书 CN 101962413 B 4 2/10 页 5 0014 1) 序列表中的序列 2 所示的氨基酸序列组成的蛋白 ◈ღ★✿； 0015 2) 将序列 2 的氨基酸序列经过几个氨基酸残基的取代◈ღ★✿、 缺失或添加且具有透皮能 力和人白细胞介素 -10 活性的由 1) 衍生的蛋白◈ღ★✿。 0016 上述序列表中序列2由403个氨基酸残基组成◈ღ★✿， 自氨基(N)端第1-11

　　14◈ღ★✿、位为TD-1的 氨基酸残基序列◈ღ★✿， 自氨基端第12-171位为人IL-10的氨基酸残基序列宠妃易孕系统◈ღ★✿， 自氨基端第172-403 位为人 IgG Fc-1 的氨基酸残基序列◈ღ★✿。所述几个氨基酸残基的取代◈ღ★✿、 缺失或添加为不超过 10 个氨基酸残基的取代◈ღ★✿、 缺失或添加pp电子首页◈ღ★✿。 0017 编 码 上 述 具 有 透 皮 能 力 和 白 细 胞 介 素 -10 活 性 的 融 合 蛋 白 的 基 因 (TD1-IL10-IgG/Fc-1) 也属于本发明的保护范围pp电子首页◈ღ★✿， 是下述 1)-4) 中任一所述基因 ◈ღ★✿： 0018 1) 序列表中序列 1 所示的 DNA 分子 ◈ღ★✿； 0019 2) 序列表中序列 1 自 5 末端第 256-1

　　15◈ღ★✿、464 位核苷酸所示的 DNA 分子 ◈ღ★✿； 0020 3) 与 1) 或 2) 限定的 DNA 分子具有 90以上同源性且编码具有透皮能力和人白 细胞介素 -10 活性蛋白所示的 DNA 分子 ◈ღ★✿； 0021 4)在严格条件下与1)或2)限定的DNA分子杂交的且编码具有透皮能力和人白细 胞介素 -10 活性蛋白所示的 DNA 分子◈ღ★✿。 0022 所述严格条件为杂交后用含 0.1SSPE( 或 0.1SSC)◈ღ★✿、 0.1 SDS 的溶液在 65 下洗膜◈ღ★✿。 0023 上述序列表中的序列 1 由 1464 个碱基组成◈ღ★✿， 其编码序列为序列 1 自 5末端第 1-1464 位碱基◈ღ★✿， 序列 1 自 5末端第 1-

　　16◈ღ★✿、255 位碱基为具有 Kex2 单一蛋白酶酶切位点的 -Factor 信号肽片段的编码序列◈ღ★✿， 序列 1 自 5 末端第 256-288 位碱基为转运肽 TD1 的编 码序列◈ღ★✿， 序列 1 自 5 末端第 289-768 位碱基为人 IL-10 的编码序列◈ღ★✿， 序列 1 自 5 末端第 769-1464 位碱基为人 IgG Fc-1 的编码序列◈ღ★✿。 0024 含有所述融合蛋白的编码基因的重组表达载体◈ღ★✿、 转基因细胞系◈ღ★✿、 表达盒或重组菌 均属于本发明的保护范围◈ღ★✿。 0025 所述重组表达载体为将所述融合蛋白的编码基因插入pPIC9K的BamH I和EcoR I 的识别位点间◈ღ★✿， 得到重组表达载体 pPIC9K

　　17◈ღ★✿、-TD1-IL10-Fc-1◈ღ★✿。 0026 用于构建所述重组表达载体的出发载体为任意一种可在毕赤酵母中表达外源基 因的重组表达载体◈ღ★✿， 如 pPIC9K◈ღ★✿、 pPIC9◈ღ★✿、 pPIC3◈ღ★✿、 pPICZ ◈ღ★✿、 pHIL-D1◈ღ★✿、 pA0804◈ღ★✿、 pA0815 或 pPSC3K 等◈ღ★✿。 0027 所述重组菌为将所述的重组表达载体导入宿主菌得到的重组菌◈ღ★✿， 所述宿主菌优选 为毕氏酵母宠妃易孕系统◈ღ★✿， 所述毕氏酵母尤其优选为 GS115◈ღ★✿、 KM71 或 SMD1168◈ღ★✿。 0028 扩增上述融合蛋白编码基因中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内◈ღ★✿。 0029 本发明的另一个目的是提供了一种制备所述融合蛋白的方法◈ღ★✿。 0030 本发明提

　　18◈ღ★✿、供的方法包括如下步骤 ◈ღ★✿： 0031 1) 诱导培养所述重组菌◈ღ★✿， 离心收集上清液 ◈ღ★✿； 0032 2) 纯化步骤 1) 获得的上清液◈ღ★✿， 得到融合蛋白 ◈ღ★✿； 0033 在步骤 1) 中◈ღ★✿， 所述诱导培养的温度为 30◈ღ★✿， 所述诱导所用的培养基为添加有甲醇 的培养基◈ღ★✿， 所述甲醇在所述诱导所用的培养基中的浓度为 0.5 ( 体积百分含量 )◈ღ★✿， 所述诱 导方式为 ◈ღ★✿： 每隔 24h 补加甲醇至终浓度为 0.5 ( 体积百分含量 ) ◈ღ★✿； 说 明 书 CN 101962413 B 5 3/10 页 6 0034 在步骤 2) 中◈ღ★✿， 所述纯化的方式为 ◈ღ★✿： 依次进行亲和层析和分子筛层析◈ღ★✿， 所述亲和层 析的层析柱优选为 M

　　19◈ღ★✿、abselect◈ღ★✿， 所述分子筛层析的层析柱优选为 S200HR 预装柱 ◈ღ★✿； 0035 所述亲和层析的洗脱液为浓度为 50mM◈ღ★✿、 pH 为 3.5 的醋酸钠水溶液 ◈ღ★✿； 0036 所述分子筛层析的洗脱液由 17.55g 氯化钠和 1000ml 浓度为 20mM◈ღ★✿、 pH 为 8.0 的 TrisHCl 缓冲液组成◈ღ★✿。 0037 所述的融合蛋白在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用 ◈ღ★✿； 或所述融合蛋白的编 码基因在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用 ◈ღ★✿； 或所述的融合蛋白在制备抑制 IFN- 产生的抑制剂中的应用 ◈ღ★✿； 或所述融合蛋白的编码基因在制备抑制 IFN- 产生的抑制剂中 的应用 ◈ღ★✿； 上述应用均为本发

　　20◈ღ★✿、明保护的范围◈ღ★✿。 0038 上述应用中◈ღ★✿， 所述自身免疫性疾病为银屑病◈ღ★✿。 0039 本发明的第三个目的是提供一种治疗自身免疫性疾病药物和一种抑制 IFN- 产 生的抑制剂◈ღ★✿。 0040 本发明提供的治疗自身免疫性疾病药物◈ღ★✿， 其活性成分为所述的融合蛋白◈ღ★✿、 所述融 合蛋白的编码基因或所述的重组表达载体◈ღ★✿。 0041 本发明提供的抑制 IFN- 产生的抑制剂◈ღ★✿， 其活性成分为所述的融合蛋白◈ღ★✿、 所述融 合蛋白的编码基因或所述的重组表达载体◈ღ★✿。 0042 需要的时候◈ღ★✿， 在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体◈ღ★✿。所述载 体包括药学领域常规的稀释剂◈ღ★✿、 赋形剂◈ღ★✿、 填充剂◈ღ★✿、 吸收促进剂或吸附载体等◈ღ★✿。 0043 本

　　21◈ღ★✿、发明的药物可以制成涂抹膏剂◈ღ★✿， 可以按照药学领域的常规方法制备◈ღ★✿。 0044 本发明为解决上述 IL-10 治疗银屑病中的问题◈ღ★✿， 设计了 TD1-IL10-Fc 融合蛋白的 方案◈ღ★✿， 希望利用 TD-1 透皮的运载能力和缓释效果◈ღ★✿， 通过局部透皮给药方式◈ღ★✿， 达到增加局部 药物浓度◈ღ★✿、 同时避免系统性免疫抑制剂所致副作用的治疗效果◈ღ★✿。 希望以此这项研究为模型◈ღ★✿， 建立蛋白质药物透皮给药的新途径◈ღ★✿。 0045 本发明建立了酵母表达体系◈ღ★✿， 获得了纯化的 TD1-IL10-Fc 融合蛋白 ◈ღ★✿； 体外透皮实 验证实◈ღ★✿， TD1-IL10-Fc 具有良好的免疫抑制活性◈ღ★✿， 并可透过皮肤◈ღ★✿， 进入血液◈ღ★✿。本发明的实验 证明◈ღ★✿， 利用毕

　　22◈ღ★✿、赤酵母发酵表达系统◈ღ★✿， 生产出具有透皮能力和白细胞介素 10 活性的融合蛋白 TD1-IL10-IgG/Fc 融合蛋白◈ღ★✿， 为下一步临床前研究 TD1-IL10-IgG/Fc 融合蛋白的治疗作用 打好基础◈ღ★✿。 0046 本发明的实验证明◈ღ★✿， 本发明提供了的具有透皮能力和白细胞介素 -10 活性的融合 蛋白◈ღ★✿， 表达量可达 10mg/L◈ღ★✿， 易纯化◈ღ★✿， 生产周期短◈ღ★✿， 生产规模容易放大◈ღ★✿， 制备成本较低的优点◈ღ★✿。 基于上述优点◈ღ★✿， 本发明的融合蛋白及其编码基因在医学和生物制药领域◈ღ★✿， 尤其是在治疗自 身免疫性反应特别是银屑病药物的制备领域具有较大的实际意义和广阔的应用前景◈ღ★✿。 附图说明 0047 图1为具有透皮能力和白细

　　24◈ღ★✿、白抑制 PHA 诱导 PBMC 产生 IFN- 的活性 0051 图5为具有透皮能力和白细胞介素-10活性的融合蛋白在大鼠体内的血药浓度曲 线 具有透皮能力和白细胞介素 -10 活性的融合蛋白的透皮能力检测 具体实施方式 0053 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明◈ღ★✿， 均为常规方法◈ღ★✿。 0054 下述实施例中所用的材料◈ღ★✿、 试剂等◈ღ★✿， 如无特殊说明◈ღ★✿， 均可从商业途径得到◈ღ★✿。 0055 下述实施例中的所有引物合成和测序工作均由上海生工完成◈ღ★✿。 0056 实施例 1◈ღ★✿、 具有透皮能力和白细胞介素 -10 活性的融合蛋白编码基因的获得 0057 用 PCR 法扩增本发明具有透皮能力和白细

　　26◈ღ★✿、酶酶切位点的 - 因子信号肽片段的编码序列◈ღ★✿， PCR 反应条件 为 ◈ღ★✿： 先 94 2 分钟 ◈ღ★✿； 然后 94 30 秒◈ღ★✿， 55 40 秒◈ღ★✿， 72 30 秒◈ღ★✿， 共 32 个循环 ◈ღ★✿； 最后 72 10 分 钟◈ღ★✿。反应结束后◈ღ★✿， 对 PCR 扩增产物进行 1琼脂糖凝胶电泳检测◈ღ★✿， 得到一条大小约 250bp 的 条带◈ღ★✿， 与预期结果相符◈ღ★✿。用 BBI 公司的 PCR 产物回收试剂盒回收目的条带◈ღ★✿， 该片段命名为 “a-factor” ◈ღ★✿。 0061 2)3 端连接具有透皮肽 TD-1 序列◈ღ★✿， 具有 Kex2 单一蛋白酶酶切位点的 - 因子 (-Factor) 信号肽片段编码序列的扩增 0062 以pPIC9K质粒(

　　32◈ღ★✿、CR 反应条件为 ◈ღ★✿： 先 94 2 分钟 ◈ღ★✿； 然后 94 30 秒◈ღ★✿， 55 40 秒pp电子首页◈ღ★✿， 72 1 分钟pp电子首页◈ღ★✿， 共 30 个循环 ◈ღ★✿； 最后 72 10 分钟◈ღ★✿。反应结束后◈ღ★✿， 对 PCR 扩增产物进行 1琼脂糖凝胶电泳检测◈ღ★✿， 得到一条大小约 540bp 的条带◈ღ★✿， 与预期结果相符◈ღ★✿。 用 BBI 公司的 PCR 产物回收试剂盒回收目的条带◈ღ★✿， 该片段命名为 “TD1-IL10/1” ◈ღ★✿。 0069 三◈ღ★✿、 5 端连接 -Factor 信号肽片段编码序列的人白细胞介素 10 的基因的扩增 0070 1)5 端连接具有 Kex2 单一蛋白酶酶切位点的 -Factor 信号肽片段编码序列的 人白细胞介素 10 基因的扩

　　37◈ღ★✿、72 1 分钟◈ღ★✿， 共 32 个循环 ◈ღ★✿； 最后 72 10 分钟◈ღ★✿。反应结束后◈ღ★✿， 对 PCR 扩增产物进行 1琼 脂糖凝胶电泳检测◈ღ★✿， 结果得到一条大小约 700bp 的条带◈ღ★✿， 与预期结果相符◈ღ★✿， 用 BBI PCR 产物 回收试剂盒回收目的条带◈ღ★✿， 该片段命名为 “-IgG Fc-1” ◈ღ★✿。 0076 五◈ღ★✿、 具有透皮能力和白细胞介素 10 活性的融合蛋白编码基因的获得 0077 1)3 端连接具有 IgG Fc-1 序列◈ღ★✿， 5 端连接具有 Kex2 单一蛋白酶切位点的 a- 因 子的人 IL-10 基因的扩增 0078 以步骤四扩增的 “-IgG Fc-1” 基因和步骤三扩增的 “-Factor-IL1

　　43◈ღ★✿、01962413 B 9 7/10 页 10 0084 序列表中序列 2 由 403 个氨基酸残基组成◈ღ★✿， 自氨基 (N) 端第 1-11 位为转运肽 TD1 的氨基酸残基序列◈ღ★✿， 自氨基 (N) 端第 12-171 位为人 IL-10 的氨基酸残基序列◈ღ★✿， 自氨基端第 172-403 位为人 IgG Fc-1 的氨基酸残基序列◈ღ★✿。 0085 实施例 2◈ღ★✿、 具有透皮能力和白细胞介素 10 活性的融合蛋白基因在毕赤酵母中的表 达及表达产物的纯化 0086 一◈ღ★✿、 具有白细胞介素 -10 活性融合蛋白基因的毕赤酵母表达载体的构建 0087 构建具有白细胞介素 -10 活性的融合蛋白基因的毕赤酵母表达载体的具

　　49◈ღ★✿、n 公 司的产品说明书)中◈ღ★✿， 以GS115/pPIC9K为对照◈ღ★✿， 在30◈ღ★✿、 250rpm下培养至OD600约为2-6◈ღ★✿， 分 别离心收集细胞◈ღ★✿， 用含体积百分浓度 0.5甲醇的 BMMY( 培养基配方参见 invitrogen 公司 的产品说明书 ) 进行诱导◈ღ★✿， 每隔 24h 补加 0.5甲醇 ( 体积百分含量◈ღ★✿， 甲醇占初始发酵培养 基体积的百分含量◈ღ★✿。 )◈ღ★✿， 第4天停止诱导◈ღ★✿， 将离心收集的菌体细胞加入含体积百分浓度0.5 说 明 书 CN 101962413 B 10 8/10 页 11 甲醇的 BMMY 的当天记作第 0 天◈ღ★✿。将发酵容器中所有物质记作培养物◈ღ★✿。 0094 培养结束后宠妃易孕系统◈ღ★✿， 10000g 离心 10 分钟◈ღ★✿， 分别收集上清液◈ღ★✿， 分别得到融合蛋白◈ღ★✿， 命名为 IL10-IgG/Fc-1 和 TD1-IL10-IgG/Fc-1◈ღ★✿。将发酵容器中的所有产物记作培养物◈ღ★✿。 0095 采用同样的方法对重组菌 GS115/pPIC9K 进行诱导表达◈ღ★✿、 收集上清液得到对照蛋 白◈ღ★✿。 0096 3◈ღ★✿、 阳性克隆表达产物的鉴定 0097 1) 用 ELISA 法测定培养上清中融合蛋白的表达量 0098 采用 Bender 公司的人 IL-10ELISA 试剂盒 ( 购自 Bender 公司◈ღ★✿， 货号 BSM215/ MST) 并参照试剂盒说明书对步骤 2 得到的融合蛋白 IL10-IgG

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